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6 | 2013

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TECHNIK UND MANAGEMENT

TECHNIK UND MANAGEMENT Mess-/Leittechnik Bakterien ohne Kultivierung zählen Per Durchflusszytometrie kann die Anzahl von Bakterien in Trink- und Nutzwasser schnell und zuverlässig bestimmt werden. Neue, kompakte und robuste Analysegeräte erlauben auch den mobilen Einsatz der Messmethode außerhalb eines Labors. Matthias Steinberg Die Gesamtzahl aller vorhandenen Bakterienzellen ist ein Parameter zur Beschreibung des mikrobiellen Zustands vonWasser.Bei derTrinkwasseraufbereitung gibt der Wert Aufschluss über die korrekte Funktion einzelner Aufbereitungsstufen innerhalb eines Wasserwerks.Störungender Wasseraufbereitungsprozesse und Verunreinigungen des Trinkwassers imVerteilernetz lassen sichanhand derbakteriellenGesamtzellzahl erkennen und ermöglichen dadurch,potenzielle Gefahren für den Konsumenten zu identifizieren. Derartige Untersuchungen sind auch dort interessant, wo Wasser transportiert und verbraucht wird, alsoinVerteilernetzen,Hausinstallationen, mobilen Trinkwasserreservoirs in Flugzeugen undSchiffen sowie in Schwimmbädern undBadeseen. Bisher: AMK-Methode Traditionell wird die Anzahl der Keime im Wasser durch die Plattierung einer Wasserprobe auf einem Nährbodenbestimmt. Nach derVermehrung der Bakterien zu sichtbaren Kolonien kann die Anzahl der aufgewachsenen Kolonienmakroskopischbestimmt werden und dient als Indikator für die Menge anBakterien in der Ausgangsprobe (aerob mesophile Keime –AMK- Methode). Es dauert drei bis zehn Tage, bis sichtbare Bakterienkolonien entstehenund gezählt werden können. Das CyFlow Cube 6der Partec GmbH ist ein neues Analysegerät, das mobilen Gesamtzellzahlmessungen außerhalb von Labors ermöglicht. Viele Bakterien nicht kultivierbar Allerdings istder AMK-Wert kein idealer Messparameter für die Bewertung des mikrobiellen Zustands eines Wassers. Vonden im ÖkosystemWasser vorkommenden Bakterien besitzen typischerweise nurweniger als 1Prozentder Bakterien die Fähigkeit, sich inder stationären Phase des Ökosystems „Nährboden“ zu vermehrenund sichtbareKolonien zu bilden. 99 Prozent der Bakterien finden auf dem Nährboden keine geeigneten Wachstumsbedingungen oder werden durch schnell wachsende Bakterien in ihrer Entwicklung gehemmt. Der Großteil der vorhandenen Bakterien istdaherauf dem Nährboden nicht kultivierbar. Diese Tatsache mindert die Aussagekraftdes AMK-Wertes. Laser-induzierte Partikelzählung In der alternativ einsetzbaren Durchflusszytometrie werden in wässeriger Lösung suspendierte Partikel oder Zellen ineiner gläsernen Durchflusskapillare einzeln aneinem Laserstrahl vorbeigeführt.Die Wechselwirkungen zwischendem Laserstrahl und demPartikel oder derZelle erzeugen gestreutes Licht und können Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen die Partikel beladen sind, zur Fluoreszenz anregen. Photodetektoren nehmen diese Streulicht- und Fluoreszenzsignale für jede einzelne Zelle auf. Als Resultat liefert eine durchflusszytometrischeMessung Informationenüber Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften vieler Zellen, mit deren Hilfe diese auch gezählt werden können (siehe Grafik 1). Zur Unterscheidung der Bakterien von anderen Partikeln wird 1Milliliter der Wasserprobe mit einem Fluoreszenzfarbstoff versetzt, der sich nur mit der in den Bakterienzellen vorhandenen DNS, der Erbmasse der Zellen, verbindet. Die somarkierten Bakterien erzeugen im Laserstrahl Lichtsignale einer bestimmten Farbe und werden damit als Bakterien identifiziert. Andere Kleinstpartikel streuen zwar auch das Laserlicht, erzeugen aber keine farbigen Fluoreszenzsignale. Die Färbung der Proben dauert nur zehn Minuten, die 44 UmweltMagazin Juni 2013

Bild und Grafiken (2): Partec Grafik 2: Die Entwicklung der Gesamtzahl von Mikroorganismen imVerlauf der Trinkwasseraufbereitung. Am Ende sollte ein mikrobiologisch stabiles Trinkwasser stehen. Grafik 1:Funktionsprinzip des Durchflusszytometers: (1) Markierung der Mikroorganismen mittels DNS-spezifischer Fluoreszenzfarbstoffe, (2) Messung der Fluoreszenzsignale nach Anregung durch Laserlicht und (3) Darstellung des Messergebnisses anhand der Fluoreszenzintensität bei unterschiedlichen Wellenlängen des Lichtes (jeder Punkt entspricht einem gemessenen Bakterium). anschließende Zählung im Durchflusszytometer 90 Sekunden. Über dieses Färbeverfahren werden nicht nur die auf Nährboden kultivierbaren Keime, sondern alle in der Wasserprobe vorhandenen Bakterien erfasst. Neben der Zählung lassen sich die Bakterien gemäß ihrer DNS-Gehalte in Low Nucleic Acid (LNA)- und High Nucleic Acid (HNA)-Bakterien differenzieren. Durch die Nutzung eineszweitenFluoreszenzfarbstoffes, der nur tote und absterbende Zellen markiert, ist die weitere Differenzierung in lebende und tote Bakterien möglich. Hierdurch kann die Wirksamkeit von Desinfektionsmaßnahmen in kurzer Zeitbeurteilt werden. Mobiler Einsatz Durchflusszytometer haben sich von relativ großen, stationären Labor-Analysegeräten zu kompakten, robusten und transportablen Analyseeinheiten, wie dem CyFlow Cube 6(siehe Bild), entwickelt. Derartige Systeme nutzen wartungsfreie, diodengestützte Lasertechnologie. Sie können problemlos transportiert und außerhalb des fürzellbiologische Analysesysteme typischen Labors eingesetzt werden. Damit wird ihr Einsatz direkt am Quellbrunnen, im Wasserwerk, beimEndverbraucheroder bei mobilenEinheiten, wie zumBeispiel in Flugzeugen, denkbar. Die einfache Färbeprozedur, die nicht auf weiteres Laborinventar angewiesen ist, unterstützt dasKonzept. Die Vorteile der Durchflusszytometrie: 7 Die Methode istschnell. Eine Analyse dauert, inklusive der Probenvorbereitung, nur wenige Minuten anstatt einiger Tage. Die material- und zeitaufwändigen Plattierungen werden vermieden. Auf Veränderungen des mikrobiologischen Zustands eines Wassers kann sofort reagiert werden (siehe Grafik 2). 7 Im Durchflusszytometer werden alle Mikroorganismen einer Wasserprobe gezählt –unabhängig von Art, Zustand und Kultivierbarkeit auf Nährmedium. 7 Die kompakten Geräte sind einfach zu benutzen und bieten neben der Bestimmung der Gesamtzellzahl weitere Möglichkeiten, um Aspekte einer mikrobiellen Lebensgemeinschaft im Trinkwasser zu untersuchen. 7 Der mobile Einsatz erlaubtneue Konzepte bei derTrink-und Nutzwasserkontrolle. Perspektiven Für die Zukunft der Durchflusszytometrie in der Wasseranalytik istdie Entwicklung von tragbaren Handheld-Geräten denkbar. Umdie regulatorischen Bedingungen für einen breiten Einsatz innerhalb der Trinkwasserproduktion erfüllen zu können, ist eine zunehmende Standardisierung notwendig. DieimJahr 2012 erfolgte Aufnahmeder Bestimmung der Gesamtkeimzahl mittels Durchflusszytometrie in das Schweizer Lebensmittelbuchist hierein erster bedeutenderSchritt, demweitere nationale und internationale Qualifizierungen folgen müssen. Technologisch führt Standardisierung in Richtung Automatisierung, sowohl hinsichtlich der Probenvorbereitung, als auch hinsichtlich der Analytik. Indiesem Zusammenhang ist besonders die Entwicklung von integrierten durchflusszytometrischen Analysesystemen zur Online-Überwachung der Gesamtzellzahl und derZellvitalität zu nennen. Dipl.-Biol. Matthias Steinberg, Partec GmbH, Münster, m.steinberg@partec.com UmweltMagazin Juni 2013 45

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